Serwisy internetowe Uniwersytetu Warszawskiego Nie jesteś zalogowany | zaloguj się


Badanie apoptozy metodą cytometrii przepływowej

Witamy na wiki Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Zastosowanie

Analiza cytometryczna pozwala rozróżnić komórki martwe na komórki apoptotyczne i na komórki nekrotyczne. Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu faktu, że we wczesnym stadium apoptozy następuje przeniesienie umiejscowionej w błonie fosfatydyloseryny ze strony cytozolowej na zewnątrz komórki.Do fosfatydyloseryny dołącza się sprzężona z fluoresceiną aneksyna. Do prób dodaje się również barwiący DNA jodek propidyny, który wnika przez poluźnioną błonę martwych komórek. Równoczesne podanie jodku propidyny i aneksyny pozwala na rozróżnienie zdrowych komórek, komórek nekrotycznych oraz wczesno i późno-apoptotycznych. W lewym dolnym kwadracie lokują się zdrowe komórki, do których nie wnika jodek propidyny ani nie przyłącza się aneksyna. W lewym górnym kwadracie znajdują się absorbujące jodek propidyny komórki nekrotyczne, które posiadają fosfatydyloserynę po cytozolowej stronie błony, w związku z czym nie wiążą aneksyny. Prawy dolny kwadrat zawiera komórki znajdujące się we wczesnej apoptozie wiążące aneksynę, których plazmalemma jest szczelna i nie przepuszcza do wnętrza jodku. W prawym górnym kwadracie znajdują się komórki z rozszczelnioną błoną w środkowym i późnym stadium apoptozy, które wiążą aneksynę i absorbują jodek propidyny.

[Źródło: Praca magisterska 2008, Izabela Chojnicka]

Przepis

  1. Zebrać medium znad hodowli komórek zwierzęcych (na szalkach).
  2. Dodać trypsynę (100 µl) i usunąć resztki medium.
  3. Następnie ponownie dodać trypsynę (500 µl) i inkubować komórki 5-10 min.
  4. Gdy komórki odkleją się od dna szalki, dodać medium (2,5 ml) i zwirować zawiesinę(1200 rpm, 8 min., 20oC)
  5. Zlać supernatant. Zliczyć komórki w komorze Bürkera, obliczyć stężenie w 1 ml.
  6. Zawiesić komórki w buforze do aneksyny, tak by otrzymać stężenie ok. 10 mln komórek/1 ml.
  7. Następnie umieścić 100 µl zawiesiny w probówce i dodać jodek propidyny (10 µl) oraz aneksynę (5 µl).
  8. Inkubować komórki w ciemności w ciągu 15 min.
  9. Przeprowadzić pomiar w cytometrze przepływowym maksymalnie wprzeciągu 60min od zakończenia inkubacji komórek z jodkiem propidyny i aneksyną.

Uwagi

osobiste