Serwisy internetowe Uniwersytetu Warszawskiego Nie jesteś zalogowany | zaloguj się


Izolacja DNA z krwi metodą wysalania (skala makro)

Witamy na wiki Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Spis treści

Zastosowanie

Izolowanie DNA z krwi: 1-10 ml. Krew musi zostać uprzednio pobrana do probówek zawierających EDTA (nie heparynę! - DNA nie nadaje się potem do żadnych analiz). EDTA zapobiegnie krzepnięciu. Po pobraniu krew należy zamrozić w -20oC. Zamrożona krew może być przechowywana nawet kilka lat.

Przepis

Roztwór A

Roztwór lizujący:

  • sacharoza 218 g
  • Tris pH=7.5 20 ml
  • MgCl2 10ml
  • H2O do 2 l
  • Triton X 20 ml

Roztwór B

Bufor TE

Przed rozpoczęciem izolacji

Przygotować roztwór A, schłodzić wirówkę do 4oC, podpisać Falcony, przygotować miskę z lodem, wydrukować listę (np. nazwisk pacjentów, których krew będziesz izolować - etykietki z nazwiskami przykleisz do eppendorfów, w których będziesz przechowywać wyizolowane DNA).

Na lodzie

  1. Do probówki 50 ml (Falcon) przelać krew.
  2. Dodać zimnego (4oC) roztworu A do 50 ml.
  3. Wstrząsnąć, obejrzeć pod lampą czy nie ma zamarzniętych kawałków lub dużych skrzepów (zamarznięte kawałki rozpuścić, duże skrzepy wyjąć, rozdrobnić i włożyć z powrotem).
  4. Odczekać 10 min., mieszając kilka razy.
  5. Odwirować 10 min. w 4oC / 3500 rpm. (we wcześniej schłodzonej wirówce).
  6. Zlać supernatant do zlewu pozostawiając pelet.
  7. Dodać 35 ml roztworu A, wstrząsnąć mocno by pelet się oderwał, ustawiać wokół miski
  8. Wirować na maks. obrotach 10 min.
  9. Zlać supernatant do zlewu, ustawić probówki na ręcznikach dnem do góry /odsączyć/.
  10. Dodać 3 ml roztworu B /do roztworu B przed użyciem dodać 1,25 ml 20% SDS na 50 ml.
  11. Dodać min 30 μl proteinazy K (20 mg/ml) - inkubować przez noc w 37oC z wytrząsaniem - do strawienia peletu (opcjonalnie 2-4 godz. w 56oC).
  12. Schłodzić do ok. 4oC.
  13. Dodać 1 ml nasyconego NaCl (6M).
  14. Odwirować 15 min. / 5100 rpm., w temp. 15oC/
  15. Ostrożnie (pelet jest b. delikatny) przenieść supernatant pipetą do nowej oznaczonej probówki i dodać do 15 ml zimnego (-20oC) Etanolu 96%.
  16. Przygotowujemy na każdą próbkę DNA dwie probówki Eppendorfa /do każdej dajemy do pełna 70% etanolu / i jedną zakręcaną-do której nalepiamy etykietkę z numerem.
  17. Wyławiamy z Falcona kłaczek DNA /tipsem/, płuczemy kolejno w obu probówkach z etanolem, umieszczamy w probówce zakręcanej trochę powyżej dna na ściance.
  18. Zawiesić uzyskane DNA w buforze TE /biorąc pod uwagę ilość mat. dodać odpowiednio 30-200μl TE. Stoi w temp. pok.

Uwagi

Temperatura 56oC to optimum działania proteinazy K - można zostawić probówki w tej temperaturze na noc, po prostu szybciej się zużyje proteinaza K. Z kolei 37oC to minimalna temperatura, przy której proteinaza K jest aktywna.

Czasem się zdaża, że proteinaza gorzej działa itp., bo np. długo stała w lodówce. Wówczas można dodać więcej proteinazy K - np. 100 μl.

osobiste