Serwisy internetowe Uniwersytetu Warszawskiego Nie jesteś zalogowany | zaloguj się


Izolacja DNA z krwi metodą wysalania (skala mikro)

Witamy na wiki Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Spis treści

Zastosowanie

Izolowanie DNA z krwi: < 1 ml. Krew musi zostać uprzednio pobrana do probówek zawierających EDTA (nie heparynę! - DNA nie nadaje się potem do żadnych analiz). EDTA zapobiegnie krzepnięciu. Po pobraniu krew należy zamrozić w -20oC. Zamrożona krew może być przechowywana nawet kilka lat.

Przepis

Roztwór A

Roztwór lizujący:

  • sacharoza 218 g
  • Tris pH=7.5 20ml
  • MgCl2 10ml
  • H2O do 2 l
  • Triton X 20ml

Roztwór B

Bufor TE

Przed izolacją

Przygotować roztwór A, schłodzić wirówkę do 4oC, podpisać Falcony, przygotować miskę z lodem, wydrukować listę (np. nazwisk pacjentów, których krew będziesz izolować - etykietki z nazwiskami przykleisz do eppendorfów, w których będziesz przechowywać wyizolowane DNA).

Na lodzie

  1. Do probówki 1,5 ml dodać 100 μl krwi płynnej (NIE może być pobrana na heparynę!).
  2. Dodać 1 ml zimnego (4oC) roztworu A.
  3. Wstrząsnąć, obejrzeć pod lampą czy nie ma skrzepów (skrzepy wyjąć, rozdrobnić i włożyć z powrotem).
  4. Odczekać 5 min., mieszając kilka razy.
  5. Odwirować 5 min. w 4oC / 14000 rpm. (we wcześniej schłodzonej wirówce).
  6. Zlać supernatant do zlewu pozostawiając pelet.
  7. Dodać 1 ml roztworu A ,wstrząsnąć mocno by pelet się oderwał, ustawiać na lodzie
  8. Wirować 5 min. w 4oC / 14000 rpm.
  9. Zlać supernatant do zlewu, ustawić probówki na ręcznikach dnem do góry /odsączyć/
  10. Dodać 60 μl roztworu B /do roztworu B przed użyciem dodać 1,25 ml 20% SDS na 50 ml./.
  11. Dodać min 4 μl proteinazy K (20mg/ml) - inkubować przez noc w 37oC. z wytrząsaniem- do strawienia peletu (opcjonalnie #Schłodzić do ok. 4oC.
  12. Dodać 20 μl nasyconego NaCl (6M).
  13. Odwirować 5 min. / 14000 rpm., w temp. 4oC/
  14. Przenieść supernatant do nowych opisanych probówek i dodać do 200 μl zimnego (-20oC) Etanolu 96%.
  15. Delikatnie zlać etanol – uważać na delikatny pelecik !!! /do każdej probówki dajemy 200 μl 70% etanolu.
  16. Odwirować 5 min. / 14000 rpm., w temp. 4oC/
  17. Zawiesić uzyskane DNA w buforze 20 μl TE . Stoi w temp. pok.


Uwagi

osobiste